Cuatro métodos para controlar el pH en biorreactores

Mantener el pH en niveles biológicamente saludables es potencialmente la herramienta más potente del bioprocesamiento aguas arriba para aumentar los títulos de producto.

Mantener el pH en niveles biológicamente saludables es potencialmente la herramienta más potente del bioprocesamiento aguas arriba para aumentar los títulos de producto. Las biorreacciones son caras y se desarrollan en plazos largos, por lo que es fundamental aprovechar al máximo cada lote.

Las células de mamífero solo son viables en entornos con un pH entre 7,1 y 7,4. Sin embargo, las células producen de forma natural dióxido de carbono como subproducto de la respiración, lo que hace bajar el pH. Las células disponen de forma natural de mecanismos para eliminar el dióxido de carbono y evitar acumulaciones tóxicas, y de sistemas tampón para mantener su pH en niveles saludables. Los biorreactores deben imitar estas características para garantizar que las células puedan prosperar.

¿Qué influye en el pH del cultivo?

Al comienzo de un lote de biorreactor, el tampón del medio de cultivo mantiene el pH en los niveles deseados. Incluso puede inyectarse dióxido de carbono por burbujeo para mantener el pH bajo. Pero durante la fase de crecimiento exponencial del cultivo, las células generan grandes cantidades de dióxido de carbono como producto de desecho metabólico. El tampón se agota y el pH desciende rápidamente.

En ese momento hay que subir el pH del cultivo. Históricamente se bombeaba una base al medio de cultivo. Ahora, las configuraciones de biorreactor más recientes utilizan macrodifusores para introducir burbujas grandes de aire o nitrógeno. Estas burbujas no se disuelven con facilidad, por lo que arrastran el dióxido de carbono del cultivo y lo llevan al espacio de cabeza del biorreactor, donde se elimina.

La bibliografía reciente ha estudiado de cerca los medios más eficaces para controlar el pH en un biorreactor. Aquí clasificamos cuatro enfoques de control del pH, del menos eficaz al más eficaz.

El menos eficaz: mantener constante la pCO2

La presión parcial del dióxido de carbono disuelto (pCO2) en un cultivo es un parámetro de proceso crítico por su efecto en el pH intracelular y extracelular. La pCO2 determina el gradiente de concentración por el que el dióxido de carbono intracelular (generado como subproducto del crecimiento celular) sale de las células y pasa al medio de cultivo. Si la pCO2 es demasiado alta, el CO2 no puede salir de las células, por lo que el pH intracelular descenderá y las células morirán. Si la pCO2 es demasiado baja, las células pierden CO2 demasiado rápido, su pH aumentará y el entorno intracelular será demasiado básico para que las células sean viables.

La pCO2 afecta al pH, pero no están estrechamente correlacionados

Especialmente dentro del intervalo de pH tamponado, la pCO2 y el pH no están directamente correlacionados. Por lo tanto, la pCO2 ofrece mucha menos información sobre la salud del cultivo que la medición del pH.

La razón principal es que, con pequeños cambios de pH dentro del ámbito de viabilidad celular (pH 7,1 – 7,4), el tampón de bicarbonato del medio (extracelular) afectará a la pCO2 según el principio de Le Chatelier.

Además, las células de mamífero generan lactato, además de dióxido de carbono, como subproducto de la respiración. El lactato y el CO2 hacen el cultivo más ácido, pero el efecto del lactato sobre el pH no se refleja en la medición de la pCO2.

Una vez que el tampón se agota y el pH empieza a descender de forma significativa, la pCO2 y el pH están mucho más relacionados. Pero sigue sin ser un medio sólido para supervisar y controlar el pH, que es la variable que realmente importa para aumentar los títulos celulares.

Menos eficaz: bombear una base al cultivo

Las células producen grandes cantidades de dióxido de carbono durante la fase de crecimiento exponencial, lo que provoca descensos importantes del pH. Una solución sencilla es bombear una base al biorreactor mediante la retroalimentación directa de los sensores de pH.

Este método es más eficaz en:

- Biorreactores más pequeños, donde los efectos de una mezcla desigual y de la localización del pH pueden ser despreciables.

- Entornos con pCO2 baja y pH bajo, donde las células generan CO2 que se disuelve rápidamente, reduce aún más el pH y no puede eliminarse con gases de burbujeo.

- Fermentadores fermentadores que cultivan células microbianas, que son más resistentes que las células de mamífero. Pueden soportar una mayor agitación y mezcla, y son menos sensibles a las fluctuaciones del pH.

Bombear una base no garantiza un pH constante en todo el biorreactor

Para obtener un título de producto alto, el pH debe ser constante en todo el biorreactor, lo que exige una mezcla minuciosa. De lo contrario, habrá bolsas localizadas de pH especialmente alto o bajo. Pero la mezcla produce espuma y aumenta el esfuerzo cortante, y ambos perjudican la viabilidad celular.

Estos problemas se agravan al aumentar el tamaño del biorreactor, lo que significa que bombear una base sencillamente no escala bien. El tiempo de mezcla y la agitación deben aumentar con el tamaño del biorreactor para evitar que empeore la localización, pero esto se hace a costa de más espuma y más esfuerzo cortante.

Bombear una base también aumenta la osmolalidad (soluto por kilogramo de medio de cultivo) del cultivo. En biorreactores más grandes, esto puede reducir la viabilidad celular y el título de producto.

Más eficaz: combinar el bombeo de base y los gases de burbujeo

El método tradicional de control del pH consiste en bombear una base al biorreactor durante las primeras etapas de un cultivo celular y utilizar después gases de burbujeo durante la fase de crecimiento exponencial. La base es especialmente útil inmediatamente después de que se agote el tampón, y los gases de burbujeo ofrecen un control preciso, para obtener los máximos rendimientos de un cultivo.

Bombear una base tiene inconvenientes importantes, y los gases de burbujeo tienen ventajas importantes

Las configuraciones más actuales utilizan principalmente gases de burbujeo para controlar el pH. La bibliografía reciente se ha alejado de otros métodos para centrarse en optimizar el lazo de control de los gases de burbujeo mediante la retroalimentación del pH y de otros parámetros críticos del proceso, entre ellos la pCO2.

El más eficaz: utilizar únicamente gases de burbujeo

Los gases de burbujeo pueden controlar el pH con más precisión que los demás métodos analizados, principalmente porque pueden reaccionar más rápido a los cambios en otros parámetros críticos del proceso. La mezcla de gases de burbujeo también ofrece el control más preciso y la capacidad de responder a la mayor cantidad de información de los distintos sensores del biorreactor.

En concreto, varios factores hacen que este método sea el más eficaz:

- Los caudales de burbujeo solo están limitados por los caudales máximos de los controladores de caudal másico que alimentan los gases a los difusores. Los microdifusores y macrodifusores concretos pueden diseñarse y escalarse en función de los caudales deseados y de los principios conocidos de transferencia de masa.

- Las burbujas de gas de los difusores pueden mezclarse y distribuirse uniformemente con más rapidez que una base, y con mucha menos agitación.

- El burbujeo de gases escala muy bien, porque el caudal de burbujeo y el tamaño de las burbujas a menudo no necesitan cambiar al escalar el biorreactor. Un estudio de 2018 de Hoshan et al. mantuvo constante el caudal de burbujeo y se limitó a aumentar la aireación del espacio de cabeza para compensar el mayor tamaño del biorreactor. Observaron aumentos de título similares en biorreactores de 30 L y de 250 L simplemente configurando lazos de control más optimizados entre el pH y el aire de burbujeo.

La ingeniería inteligente de los difusores y el diseño del lazo de control son fundamentales

Si los gases entran demasiado rápido, introducen esfuerzo cortante. Si los gases entran demasiado despacio, las células no se reproducirán tan rápido como podrían y no alcanzarán el rendimiento máximo.

Los difusores bien diseñados, en cambio, escalarán bien y producirán títulos altos de forma constante.

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