Estudio del cultivo celular del insecto - nota de uso de los instrumentos de MCQ

Atmósfera modificada: aumento de la experimentación de los cultivos celulares del insecto.

Las vacunas, los antibióticos y otras medicinas esenciales han constituido siempre las necesidades básicas para nuestra sociedad. La necesidad de estas mercancías, creciente grandemente sobre el último varias décadas, lleva la ciencia moderna hacia nuevos métodos de producción confiables y eficientes de la droga. La producción en grande de medicinas básicas confía en la capacidad de sintetizar las cantidades adecuadas de proteínas específicas, expresadas naturalmente en su salvaje-tipo forma o apropiado modificadas. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas diseñadas para aumentar la producción de la proteína, es la expresión heteróloga de la proteína (HPE). La técnica de HPE es baja en los principios siguientes:

• Se selecciona el tipo de la célula que expresa naturalmente la proteína de la blanco.

• El material genético requerido para expresar la proteína de la blanco se recoge de la célula.

• El material genético se transfiere experimental en otro tipo de la célula que no exprese normalmente esa proteína.

• El tipo de la célula con los nuevos beneficios materiales genéticos insertados la capacidad de expresar la proteína de la blanco.

Los dos tipos de la célula derivan generalmente de diversos organismos, así del término heterólogo. La expresión de proteínas funcionales en anfitriones heterólogos es actualmente una piedra angular de la biotecnología moderna. Independientemente de los usos comerciales en grande, estas técnicas son una herramienta increíblemente útil para la investigación básica del laboratorio, así requiriendo mejoras constantes en velocidad, costes, y eficacia. Un paso dominante de la producción de las proteínas es el cultivo celular, durante el cual la atmósfera del sistema desempeña un papel crucial. Por este motivo, el MCQ propone sus series de la licuadora del gas como herramienta fundamental para controlar, para estudiar y para mejorar la expresión de la cultura.

Sistema del vector de la expresión del Baculovirus.

El HPE moderno explota muchos tipos de anfitriones heterólogos. Los sistemas más ampliamente utilizados de la expresión se basan en Escherichia Coli como la célula huesped. Yeats, los moldes, y las setas (es decir hongos) son otra clase importante de anfitriones (una información más detallada sobre culturas de los hongos se puede encontrar aquí [vínculo]). Relativamente un nuevo y prometedor acercamiento al sistema de la expresión en lugar de otro se basa en los anfitriones de la célula del insecto. Como bacterias y hongos, la capacidad de la expresión de las células del insecto se modifica artificial para permitir que la cultura produzca las proteínas específicas. El proceso de la modificación ocurre vía el sistema del vector de la expresión del Baculovirus (BEVS). Los pasos importantes de la técnica de BEVS se pueden resumir como para seguir:

• La pequeña parte de la codificación del filamento de la DNA (el gen) la información requerida para expresar la proteína de la blanco se transfiere en el genoma del Baculovirus vía un vector de la transferencia. El vector de la transferencia substituye un gen no esencial del Baculovirus por el gen extranjero, dejando las capacidades de la reproducción y de la infección del virus sin cambiar.

• El Baculovirus resultante (llamado recombinante) se utiliza para infectar cultivos celulares del insecto. El nuevo material genético se transfiere en las células huesped y después de pocas horas la cultura comienza a expresar la proteína deseada.

CARACTERÍSTICAS DE BEVS

• Ventajas

BEVS es ampliamente utilizado en la investigación y las comunidades industriales científicas para la producción de proteínas de alta calidad, la mayor parte de ellas originaron de las células mamíferas que son inadecuadas a las culturas del laboratorio. Esta técnica ofrece muchas ventajas sobre los otros sistemas de la cultura, incluyendo tasas de producción crecientes, producciones más altas, productos con solubilidad mejorada y la capacidad de sintetizar las proteínas con las modificaciones del posttranslational (a menudo idénticas a las que ocurren en células mamíferas). La naturaleza del Baculovirus sí mismo constituye una gran ventaja para los investigadores. La familia de Baculoviridae es uno de los grupos mayor conocidos de virus, capaces de infectar más de 500 especies de células del insecto, y más recientemente, incluso pocas de variedades de células mamíferas. El procedimiento estándar de BEVS hace uso de un Baculovirus específico, llamado Autographa Californica virus nuclear del polyhedrosis (AcNPV), especialmente conveniente para su gama estrecha del anfitrión. El AcNPV se conoce para infectar solamente pocas familias del lepidóptero (polilla) y se ha demostrado ser no infeccioso para las variedades de células mamíferas. El uso de este baculovirus específico en por lo tanto no sólo altamente selectivo para las variedades de células del insecto pero también seguro para los seres humanos.

• Desventajas

A pesar de estas ventajas potenciales, BEVS sufre algunas de las desventajas peculiares compartidas por cualquier sistema heterólogo de la expresión. Las diferencias en las proteínas expresadas por las células mamíferas y baculovirus-infectadas del insecto se han descrito, y en algunos casos, superado. Los problemas relacionados con el ciclo de la infección pueden afectar al plegamiento de proteínas, llevando eventual a la formación de agregados indeseados. Las proteínas de la tarifa de la expresión con certeza pueden ser consideradas inadecuadas y una cierta modificación del posttranslational puede ocurrir incontrolable o puede no ocurrir en absoluto.

CÉLULA CUTURE DEL INSECTO

Como dijo antes, BEVS implica el uso de un virus específico, capaz de infectar solamente las células del lepidóptero. Las células más ampliamente utilizadas del insecto son las variedades de células Sf9 y Sf21. Ambas las líneas de las células son opciones valiosas, pero las células Sf9 (que es una sub-copia de las células Sf21) son a menudo preferido debido a su tasa de crecimiento más rápida y densidades de célula más altas. Las células del insecto son convenientes para las culturas pequeñas y en grande. En caso de pequeñas culturas, los frascos de cultura de la coctelera o del hilandero pueden proporcionar las materias primas adecuadas pero para producciones más grandes, el crecimiento de las células del insecto se debe realizar en biorreactores y la cultura se supervisa constantemente con el equipo experimental avanzado.

• Oxígeno disuelto

Una supervisión y un control apropiados sobre los parámetros de trabajo son cruciales para los cultivos celulares. La composición nutritiva del medio de cultivo, el pH, la temperatura, la humedad y otros parámetros todo de la atmósfera se sujetan a un proceso constante de la optimización para mejorar los resultados de la cultura. Las células del insecto crecen problema-menos en temperatura ambiente (el grado óptimo a partir del 25 a 27°C) y sin ningún suplemento del CO2, pero todavía la atmósfera de la cultura desempeña un papel dominante en el proceso del crecimiento, para uno de los parámetros cruciales es el oxígeno disuelto (HAGA). El oxígeno atmosférico tiende espontáneamente a disolver en el agua hasta que se alcance un equilibrio de la saturación. Para el agua pura que está en contacto con una atmósfera del oxígeno puro, el valor de la saturación (es decir la cantidad del oxígeno disuelto) en 25°C y 1 barra es cerca de 8 mg/l. Puesto que la relación entre el oxígeno atmosférico y el oxígeno disuelto es directamente proporcional, cuando el oxígeno puro es substituido por una atmósfera más con poco oxígeno, HAGA las disminuciones por consiguiente. En caso del agua pura que está en contacto con el aire (el 21% de oxígeno) los resultados disueltos del oxígeno en el 21% del valor de la saturación (el tan 21% de 8 mg/l, de cerca de 1,7 mg/l). La influencia del oxígeno disuelto en cultivos celulares del insecto está bien documentada en la literatura científica. Muchas experimentaciones hacen uso del aire estándar como atmósfera de la cultura. En algunos casos, esta configuración puede demostrar ser eficaz, pero la falta un control apropiado del oxígeno es generalmente molesta. La cantidad de HACE puede ser o demasiado alta, causando una intolerancia de la célula, o demasiado bajo, causando el hambre de las células. Ambos los efectos son perjudiciales a la tasa de crecimiento de la célula y a la calidad de la expresión de la proteína. El trabajo con un sistema de control de composición de la atmósfera concede la posibilidad para emprender las experimentaciones avanzadas, en las cuales las respuestas de la cultura a diferente HACEN valores se pueden comprobar con las pruebas apropiadas, permitiendo que los investigadores encuentren la condición óptima del crecimiento para cada cultivo celular.

SOLUCIÓN DE MCQ

Para todos esos usos en los cuales un control fino sobre la composición de la atmósfera se requiera, MCQ sugiere el uso de su serie de la licuadora del gas. Las series de la licuadora del gas son los instrumentos ideales para las preparaciones de las mezclas de gases de la precisión y los usos dinámicos de las mezclas de gases. Las series de la licuadora del gas son productos profesionales diseñados para trabajar con hasta 6 mezclas de gases no-agresivas de los componentes. El instrumento está calibrado en la petición del cliente y en caso de necesidad, es posible trabajar con diversas configuraciones de los ajustes del gas con el uso del factor de conversión relacionado con cada medio del gas. Las características principales de la serie de la licuadora del gas son una alta precisión (exactitud del 1% para cada canal), una alta repetibilidad (el 0,16% de valor de la lectura) y el tiempo de respuesta más rápido para los cambios setpoint del valor disponibles en el mercado.

Liado con los instrumentos el MCQ proporciona al encargado del mezclador del gas, un software (compatible con cualquier mesa y ordenador portátil de Windows-funcionamiento de computadora personal) que asegure una manera fácil e intuitiva de manejar mezclas dinámicamente.

• Configuración de hardware

Un ejemplo de la configuración de hardware de la serie de la licuadora del gas de MCQ se representa en la imagen. El instrumento funciona con los gases secos, no-agresivos. Las fuentes del gas pueden ser puras o mezclas (en nuestros gases puros del ejemplo se han elegido para la simplicidad). Los cilindros de gas están conectados con el instrumento a través de los tubos de 6 milímetros de diámetro y una válvula de control está instalada en cada línea como dispositivo de la prevención de la expulsión. Cada medio del gas es conectado y controlado por un canal dedicado de las licuadoras del gas. Otro tubo de 6 milímetros finalmente conecta el instrumento con el sistema de trabajo en el cual el experimento ocurre. UNA PC está conectada con las licuadoras del gas a través de una conexión USB simple. Todas las características de los instrumentos y las propiedades de la mezcla de gases se pueden entonces manejar con el software del encargado del mezclador del gas.